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    色谱全能冠军——聚合物色谱层析介质

    浏览次数: 日期:2020-03-23 15:09:03

    导读
      硅胶色谱填料因具有良好的机械强度、耐溶剂性、可控的比表面积和孔径大小、不溶胀和不可压缩性、且表面富含易于键合或改性的硅羟基等优点,使得硅胶成为实验室分析检测及中小分子工业分离纯化最主要填料。而天然碳水高分子改性介质(软胶)由于亲水强,生物兼容性好,能减少对生物分子的非特异性吸附等特点,因此在分离过程中容易保持生物分子的生物活性而被广泛地用于生物大分子的分离纯化过程中,也是生物大分子分离纯化应用历史最悠久,应用最多的层析介质。硅胶填料和软胶介质具有各显鲜明的特点,因此其色谱适用领域各不相同,前者主要用于中小分子的分离纯化,而后者往往用于生物大分子的分离纯化。聚合物色谱层析介质发展较晚,但由于其卓越的机械性能和极强的化学稳定性,既避免了硅胶固有不耐酸碱的缺陷,也克服了软胶机械强度差的问题,因此聚合物介质是个全能型的色谱层析介质,即可以替代硅胶作为反相色谱填料用于中小分子分离纯化,也可以替换软胶介质用于生物大分子的层析分离。本文介绍了聚合物色谱层析材料技术的发展历程和未来的发展方向。

    简介           
      液相色谱和层析技术已有上百年发展历史,色谱和层析是从Chromatography翻译过来的。通常用于小分子分离纯化和分析检测的Chromatography习惯叫色谱,而用于生物大分子分离纯化的Chromatography叫层析。色谱和层析技术可以对复杂混合组份进行有效分离而且条件温和,适用性广,已成为工业分离纯化和实验室分析检查最重要的工具。色谱和层析已广泛地用于核工业,化工,食品,和医药领域,既可以用于无机贵金属的分离富集,也可以用于有机合成药物的分离纯化,还可以用于复杂天然产物提取分离,甚至可以对物理和化学性能几乎完全一致但空间结构不同的手性分子进行拆分;更是生物分子的分离纯化主要甚至是唯一手段。无论抗生素、多肽、胰岛素,还是抗体、病毒、疫苗等各种结构复杂的生物分子分离纯化都离不开色谱和层析技术。常用小分子分离模式主要有正相色谱、反相色谱、Hilic、和手性色谱;常用生物大分子分离模式的主要有分子筛(凝胶过滤)、疏水、离子交换、亲和层析及混合层析等。
     

    1.新型分离材料的出现促进色谱分离技术的进步
      色谱填料和层析介质是整个色谱和层析分离技术的核心,不同功能化的色谱填料和层析介质是液相色谱和层析广泛应用的基础。色谱或层析分离效果很大程度上取决于色谱填料和层析介质;色谱和层析技术重大进步往往是随着新的分离材料的出现而发展的:小粒径球形多孔硅胶的出现促进了色谱分离分析的快速发展,使得高效液相色谱技术HPLC 成为分析领域应用最广,最有效的检测和分离手段;而亚2 μm的硅胶填料的发展使得超高压UPLC出现成为可能,也使得HPLC的分辨率,检测速度及柱效达到前所未有的水平;多孔核壳色谱填料的出现让普通的HPLC色谱仪器上获得UPLC 的分离速度和效果;手性色谱填料的发展使光学异构体拆分和检测变得更加容易,也促进了手性药物的快速发展;聚苯乙烯高分子色谱填料的发展使得分析分离可在全pH 范围内进行。亲水性色谱填料(HILIC)的发展使得强极性的物质得到更有效的分析和分离;碳水高分子介质的出现不仅可以有效地分离纯化生物大分子而且在分离的过程中能保持生物的活性,促进生物技术产业发展;金属螯合亲和填料的发展使得带有His-Tag 的蛋白分子可以得到快速简便的分离;Protein A 亲和填料的出现极大简化了抗体药物的分离纯化,使得Protein A 亲和层析成为抗体分离纯化的金标准。高性能新型色谱填料及层析介质的不断出现是液相色谱和层析分离和分析技术发展的有效驱动力,也是色谱和层析研究中最丰富、最富有活力、最具有创造性的研究方向之一。

    2.主要色谱填料的种类及其特点
      色谱分离材料主要有三大类:第一类是以多孔二氧化硅(硅胶)为代表的无机化合物色谱填料;第二类是以琼脂糖、葡聚糖为代表的改性碳水高分子层析介质(软胶);第三类是以交联聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯为代表的合成高分子聚合物色谱填料和层析介质,其中硅胶,聚苯乙烯,聚丙烯酸酯和多糖基软胶介质是市场上最常用色谱填料和层析介质。


      硅胶色谱填料——小分子分离纯化和分析检测首选填料
      硅胶及键合硅胶色谱填料因具有良好的机械强度、耐溶剂性、可控的比表面积和孔径大小、不溶胀和不可压缩性、及表面富含易于键合或改性的硅羟基等优点,使得硅胶成为高效色谱填料应用历史最悠久、最广泛的高效液相色谱填料之一,成为实验室分析色谱及小分子工业分离纯化主要介质。但硅胶在酸碱条件下不稳定的缺点使其不适合用于在碱性条件下分离。因此硅胶很少用于生物大分子的分离纯化。

      多糖基软胶层析介质——生物大分子分离纯化的开拓者
      天然碳水高分子(主要是琼脂糖和葡聚糖)改性填料由于具有亲水强,生物兼容性好,能减少对生物分子的非特异性吸附等特点,因此在分离过程中容易保持生物分子的生物活性而被广泛地用于生物大分子的分离纯化过程中,也是生物大分子分离纯化应用历史最悠久,应用最多的层析介质。但天然碳水改性高分子介质因其基质柔软,导致机械强度差、溶胀体积大、流速慢等缺点,因此被称为软胶;另外由于糖基介质是在溶胀状态下产生的网状孔隙结构,空阻大,大分子在这种介质的传递速度慢,在高流速条件下载量低,因此极大地限制了生物分离纯化的生产效率。

     



    3.聚合物色谱填料——后来居上的色谱全能冠军
      硅胶填料和多糖基软胶介质具有各自鲜明的特点,因此其适用范围各不相同,前者主要用于中小分子的分离纯化,而后者往往用于生物大分子的分离纯化。聚合物刚好是介于硅胶和软胶之间,即可以作为反相色谱填料替换硅胶用于中小分子分离纯化,也可以替换软胶介质用于生物大分子的层析分离。通过控制聚合物微球材料组成,孔道结构及表面修饰和功能化可以形成离子交换、疏水、亲和等不同分离模式的色谱填料和层析介质。聚合物填料基质主要包括聚苯乙烯,聚丙烯酸酯及聚丙烯酰胺等。多孔聚苯乙烯微球由于本身带有苯基疏水功能基团,表面不需要键合烷基链等疏水基团就可以直接作为反相色谱填料,其最大的优点是具有极强的化学稳定性、耐热性能和耐酸碱性能,并可在pH=1-14全范围工作,因此聚苯乙烯色谱填料使用寿命是目前所有色谱填料和层析介质中最长的,也是耐脏性能最好的,它可以通过强酸强碱溶液及有机溶剂在线清洗,以达到填料再生的目的,有利于药品纯化的稳定性和重复性。另外聚苯乙烯色谱填料的孔径可调且孔径范围选择比较大,孔径小到5纳米,大到400纳米的色谱填料都有商业化产品,因此可以满足从有机化合物小分子到多肽胰岛素再到抗体疫苗等生物大分子各种分离纯化的需求。
      聚苯乙烯色谱填料机械强度及耐压性虽然低于硅胶,但近期开发的高度交联的单分散聚苯乙烯色谱填料可耐受60公斤以上压力,完全可以满足高压制备色谱的要求,而且其柱效可以与与硅胶柱相媲美,如10微米聚苯乙烯色谱填料装到1米直径的DAC制备柱中,其柱效可高达45000塔板数每米以上。因此聚合物色谱填料柱效不如硅胶其实是个误区。柱效往往与填料颗粒大小和分布有关,与材质没有什么关系。以前聚合物色谱填料柱效普遍差于硅胶色谱填料原因主要是聚合物色谱填料密度较小,筛分较困难,因此生成的聚苯乙烯色谱填料粒径分布比较宽导致柱效低。而种子法可以制备粒径精确可控,分布均一的单分散聚合物色谱填料,因此其柱效和分辨率可以大幅度提高。当然聚苯乙烯色谱填料的也有其缺陷。其主要问题就是在有机溶剂中会溶胀,而且不同溶剂溶胀比例不同,因此会影响其柱床的稳定性。采用动态压缩柱(DAC)会明显改善其柱床稳定性,提高柱效,使得聚合物色谱填料越来越多用于高效分离纯化。另外聚苯乙烯色谱填料的孔径分布一般比硅胶宽,造成聚苯乙烯反相色谱填料的分辨率往往低于硅胶色谱填料,但聚苯乙烯色谱填料的色谱分离选择性与硅胶具有一定的互补性,首先聚苯乙烯色谱填料没有硅胶表面的硅羟基,避免了强极性和碱性物质的非特异吸附, 也改善了填料的分离效能, 即使是在中性条件下分析碱性物质, 仍能保持完美峰型。另外聚苯乙烯色谱填料可以做成超大孔贯流色谱填料。其孔径结构由贯穿孔(200 ~ 800 nm)和扩散孔(10 ~ 100 nm)组成。与仅有扩散传质的传统小孔径填料相比,分子的传质速率大大提高, 从而使分离速度加快。超大孔聚合物色谱填料尤其适合生物大分子的分离纯化。由于聚合物色谱填料极强的耐酸碱性,极长的使用寿命,使其越来越多地用于抗生素,多肽,胰岛素,天然产物的大规模分离纯化。
      除了聚苯乙烯外,聚丙烯酸酯及聚乙烯吡咯也可以作为反相色谱填料,因其含有极性功能基团,其疏水性能弱于聚苯乙烯色谱填料,使得这些材料具有一些独特的分离选择性,有利于分离强疏水的样品。
      聚苯乙烯或聚丙烯酸酯微球除了可以直接用作反相色谱填料外,还可以通过表面亲水化改性及功能化制备离子交换,疏水,分子筛及亲和层析介质以满足各种生物大分子分离纯化的需求。与软胶相比,聚合物为基质的层析介质最大的优点是其高机械强度,因此可以耐受高柱压、高流速、及较高粘度的样品,意味着在更短的时间处理更大体积的物料,缩短循环周期,提高单位时间的产量,并可以使用直径更小的层析柱。另外聚合物微球粒径大小、粒径分布更容易控制,使得聚合物填料更容易装柱,柱效和分辨率也更高。同时聚合物具有孔径大、渗透性好、分子传质速度快等优点。相反,软胶基球为网状孔道结构、孔径小、比表面积高,但其传质阻力大,因此软胶在低流速下往往比聚合物介质具有更高载量,但在高流速条件下,聚合物层析介质反而比软胶具有更高载量。聚合物层析介质的缺点是其疏水往往比软胶强,非特异性吸附大。因此聚合物微球表面往往需要进行亲水化改性以降低其非特异性吸附。



    4.国内外聚合物全能色谱填料发展状况



      传统聚合物色谱填料微球是通过悬浮聚合制备的。该方法是以水溶液为介质,把油溶性的单体和致孔剂混合液通过搅拌分散成细小的液滴,加热引发单体液滴聚合变成固体聚合物微球,然后清洗去除致孔剂,最后经过筛分分级工艺形成聚合物色谱填料。悬浮聚合法工艺简单、操作方便、有利于大规模生产,但这种方法制得的微球粒径成高斯(Gaussin)分布、粒径分布很宽,必须经过复杂分级筛分工艺去除过大和过小的微球才能满足色谱填料的需求。粒径越小筛分工艺越复杂,难度越大,即使经过复杂筛分工艺的填料其粒径仍然不够均匀。聚合物色谱填料粒径分布是影响其色谱性能最重要的参数之一。粒径分布越均匀,柱效越高,分辨率越高,柱压越低。因此直接制备粒径精确可控且高度均匀的聚合物色谱填料以避免复杂的筛分工艺一直是业界追求的目标。



      1983年挪威科学家Ugelstand研究组发明了两步或多步种子聚合法制备了5-30微米范围内的单分散聚合物多孔微球(US Patent No.4530956)。该方法是利用单分散可溶胀聚合物微球为种子,通过种子吸附非水溶性的活化剂比如邻苯二甲酸二丁酯进行活化?;罨哪康氖俏酥肿涌梢晕礁嗟挠谢ヌ?。种子在吸收了单体、致孔剂及活化剂后形成更大粒径的液滴后,通过加温聚合即可得到更大尺寸的单分散聚合物微球。Ugelstad开发的技术被Dynal公司成功地用于生产单分散聚合物色谱产品,让Dynal成为世界上提供均匀聚合物微球技术和产品的引领者,而且很长一段时间内是独霸天下。美国GE公司推出的一系列SOURCE单分散性聚苯乙烯色谱填料就是Dynal公司生产的。这种单分散聚合物色谱填料极大地改善了聚合物色谱分离和分析性能,使其分辨率,柱效,分离效果可以与市场上的反相硅胶相媲美,同时又克服了反相硅胶使用寿命短, 耐酸碱性差等缺陷。
      Ugelstad的多步种子聚合技术开创了单分散聚合物色谱填料制备技术先河,但Ugelstad 种子法技术也存在一些局限性:主要是生产工艺复杂,生产周期长,成本高,制备的微球粒径及孔径控制都有一定的局限性。因此SOURCE 填料最大的粒径是30微米,而且孔径只有100 纳米一种规格。SOURCE粒径和孔径规格受限且其价格昂贵,严重影响其在分离纯化的广泛使用。很遗憾,SOURCE 单分散聚合物色谱填料在上世纪八十年代就已经开发出来,但过去几十年来,Dynal 和 GE 在单分散聚合物色谱填料制备技术及产品拓展方面并没有更大突破和进展,世界上也没有其它公司在单分散聚合物色谱填料的制备技术上可以超越Dynal和GE。目前SOURCE 单分散聚合物色谱填料由于粒径和孔径的局限性,它即不能满足抗生素,天然产物等小分子分离纯化需要孔径小,比表面积大,粒径大且价格便宜的要求,也不能满足蛋白和抗体类生物大分子分离纯化需要大孔径和大粒径以满足低压层析的工艺要需。
      



      为了突破现有单分散聚合物色谱填料的粒径和孔径控制的局限性,纳微的技术团队经过十多年努力开发出创新性边溶胀边聚合种子法制备单分散的聚合物微球(发明专利CN200710124981.0)。该方法克服了Ugelstad 多步溶胀法的局限性:首先该方法不需要多步溶胀工艺,大大简化生产流程,缩短生产周期使得纳微可以高效率、低成本、大规模生产出单分散聚合物色谱填料;另外该方法突破Ugelstad种子法的很难做大粒径聚合物微球的局限性,使得纳微可以生产更大尺寸、更多孔径规格、及更多材质组成的的单分散聚合物色谱填料。纳微单分散聚合物色谱填料和层析介质产品规格已远超过SOURCE 产品,成为全球单分散聚合物色谱填料技术和产品的领导者。相比于Dynal 生产的SOURCE单分散聚合物色谱填料(只有一种聚苯乙烯基材,一种孔径规格,且最大粒径不超过30微米),纳微可提供100, 300, 500, 700,1000,2000,4000 A等多种孔径规格选择,及更多粒径规格(3,5, 10,15, 30, 40,50,80微米)单分散聚合物色谱填料。而且拥有聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及聚乙烯吡咯烷酮三大系列材质组成的单分散色谱填料。纳微提供更多种类和规格的单分散色谱填料极大拓广了其分离纯化的应用领域,不仅可以用于有机化药、抗生素、植物药、多肽、胰岛素等中小分子的分离纯化,而且可以用于蛋白、抗体、核酸、疫苗等大分子的分离纯化,让聚合物色谱填料真正成为色谱填料的全能冠军。

     



      纳微创新性单分散聚合物微球精准制造技术平台,可以对微球的粒径大小,粒径分布,孔径结构,材质组成及表面性能达到前所未有的控制水平,极大地推动了单分散色谱填料和层析介质制造技术的进步,拓宽了单分散聚合物色谱填料和层析介质的种类和规格的选择范围,拓宽了其在抗生素、多肽、胰岛素、蛋白、抗体、疫苗、天然产物及有机合成药物分离纯化的应用。纳微作为一家创新型公司不仅填补了国内聚合物色谱填料及产品的空白而且推动了世界色谱填料精准制造技术的进步,也促进聚合物色谱填料在药物分离纯化的广泛使用,使得聚合物色谱填料真正成为色谱全能冠军。另外,纳微还突破了单分散硅胶色谱填料精准制备技术这一世界难题,颠覆现有球形硅胶的制备方法,成为全球首个实现大规模生产粒径高度均一的单分散硅胶色谱填料的公司。纳微也是全球唯一可以同时大规模生产单分散聚合物和硅胶色谱填料的公司??梢栽て?,粒径、孔径可精确控制的单分散色谱填料和层析介质将替代多分散填料成为分离纯化应用主流的填料是必然的趋势。

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